Ennen koetta kaikki reagenssit ja näytteet on tasapainotettava huoneenlämpötilaan; uudelleensulatuksen jälkeen näytteet tulee sentrifugoida uudelleen ja ottaa supernatantti testausta varten; reagensseja tai näytteen valmistelua varten sekoita ja vältä vaahtoamista; Kalibrointia ja näytteitä suositellaan kahteen kertaan.

1. Lisää: lisää standardityöliuos vuorotellen kahteen ensimmäiseen kuoppaan ja lisää kaksi reikää kutakin työliuoskonsentraatiota kohti, 100 μ L jokaisesta kaivosta. Testattavat näytteet lisätään muihin kuoppiin, 100 μ L per kuoppa (jos näytepitoisuus ylittää testialueen, näyte laimennettu standardi- ja näytelaimennoksilla). Mikrolevy päällystettiin kalvolla ja inkuboitiin 37 °C:ssa ℃ 90 min ajan. Vinkki: Kun lisäät näytettä mikrolevyn pohjalle, älä kosketa reiän seinämää, ravista ja sekoita varovasti kuplien muodostumisen välttämiseksi. Lisäaika tulee hallita 10 minuutin sisällä.

2. Biotinyloitu vasta-aine/antigeeni: hävitä neste ja ravista kuivaksi pesemättä. 100 µl biotinyloitua vasta-aine/antigeeni-työliuosta lisättiin välittömästi kuhunkin kuoppaan, sekoitettiin, päällystettiin mikrolevyllä ja päällystettiin kalvolla ja inkuboitiin 37 ℃:ssa 1 tunti.

3. Pesu: ravista nestettä reikään, lisää 350 μl pesunestettä jokaiseen kuoppaan, liota 1-2 minuuttia, ime tai ravista mikrolevyssä oleva neste ja taputtele kuivaksi paksulle imukykyiselle paperille. Toista tämä pesulevyn vaihe 3 kertaa. Vinkki: Pesukonetta voidaan käyttää tässä ja muissa pesuvaiheissa. Jokainen pesuvaihe on tärkeä kokeen kannalta.

4. HRP-entsyymikonjugaatti: 100 μ L entsyymikonjugaatin työliuosta kuoppaa kohti, sekoitettu, päällystetty kalvolla ja inkuboitu 37 °C:ssa ℃ 30 minuutin ajan.

5. Pesu: Kaada neste kuoppaan ja pese levy 5 kertaa samalla tavalla kuin vaiheessa 3.

6. Substraatti: lisää 90 μl substraattiliuosta (TMB) jokaiseen kuoppaan, sekoita hyvin, lisää kalvopäällyste ja inkuboi 37 ℃:ssa noin 15 minuuttia. Huomautus: Inkubointiaikaa tulee lyhentää tai pidentää todellisen värinkehitystilanteen mukaan, mutta ei yli 30 minuuttia. Se voidaan lopettaa, kun vakioreiässä näkyy selkeä kaltevuus.

7. Lopettaminen: Lisää 50 μ L lopetusliuosta kuhunkin kuoppaan reaktion lopettamiseksi. Huomautus: lopetusliuoksen lisäysjärjestyksen tulee olla sama kuin substraattiliuoksen.

8. Lue: Mittaa välittömästi kunkin kuopan optinen tiheys (OD) 450 nm:ssä mikrolevylukijalla. Mikrolevylukija tulee avata etukäteen testausmenettelyn määrittämiseksi.

9. Laita käyttämätön reagenssi kokeen jälkeen takaisin jääkaappiin määritellyn säilytyslämpötilan mukaisesti säilyvyysaikaan asti.