O- spesifinen antigeenipolysakkaridi, joka tunnetaan myös nimellä O-spesifinen polysakkaridiketju, sijaitsee lipopolysakkaridimolekyylin uloimmassa kerroksessa ja koostuu useista kymmeniin (jopa 40) oligosakkariditoistoon. Jokainen oligosakkaridiyksikkö on oligosakkaridi, joka koostuu 3 - 5 monosakkaridista. Nämä monosakkaridit ovat yleensä neutraaleja sokereita ja aminosokereita. O-antigeeniketjun rakenne on lipopolysakkaridikoostumuksen vaihtelevin osa, ja sen monimuotoisuus määrää eri gramnegatiivisten kantojen antigeeniominaisuudet.

Gram-negatiivisten bakteerien O-antigeenillä on lajispesifisyyttä, joka johtuu sen polysakkaridiketjussa olevien monosakkaridien eri tyypeistä, jakautumispaikoista, järjestelysuunnista ja tilakonfiguraatioista. O-antigeeni voi reagoida spesifisesti vastaavien vasta-aineiden kanssa. Erilaisilla Escherichia colilla on eri tyyppejä ja järjestelyjä O-antigeeniketjun monosakkarideja, jotka muodostavat spesifisen antigeenisyyden. Siksi O-antigeeniketju on eri kantojen serologisen spesifisyyden rakenteellinen perusta. Tämä rakenne on myös gram-negatiivisten kantojen tärkein antigeeninen determinantti, ja useimmilla niistä on gram-negatiivisten kantojen spesifisyys, mikä voi aiheuttaa kantojen spesifisen reaktion. Pesäkkeen morfologian mukaan, kun O-antigeenipolysakkaridiketju puuttuu, se on karkeaa bakteeria ja täydellinen O-antigeenipolysakkaridiketju on sileä bakteeri.